Подходы к выбору терапии витилиго
В течение последнего десятилетия изучалась роль свободнорадикальных процессов в патогенезе витилиго. Однако систематических исследований в этом направлении практически не проводилось, а имеющиеся данные разрозненны и настолько противоречивы, что не позволяют однозначно судить о характере изменений про- и антиоксидантного статуса клеток кожи.
Способность клеток кожи образовывать пигмент меланин является специфическим механизмом ее защиты от ультрафиолетового облучения. Нарушения меланиновой пигментации (меланозы) имеют разнообразные клинические проявления. Наиболее распространенное заболевание из гипомеланозов — витилиго. Актуальность проблемы витилиго связана с его широким распространением в разных регионах и среди многих этнических групп, значительным влиянием заболевания на психосоциальный статус пациентов, отсутствием надежных терапевтических методов.
Согласно данным ряда авторов, накопление продуктов свободнорадикального окисления — важное патогенетическое звено развития витилиго, по мнению других, недостаточность обеспечения антиоксидантами является основным механизмом снижения активности меланоцитов. Развивая подобный теоретический подход, предлагаются и соответствующие способы терапии — с помощью накожного или внутреннего применения антиоксидантов — как небелковой, так и белковой природы, чаще всего рекомбинантных форм. Есть сообщения о клинической эффективности подобных подходов, но нет информации относительно долговременности проявляющегося защитного эффекта.
Однако в клинике давно применяют методы лечения витилиго, различные по природе воздействующего фактора, но со сходным механизмом действия — активацией на начальном этапе свободнорадикального окисления и увеличением уровня активных форм кислорода (АФК). К ним относятся терапия с помощью ультрафиолетовых волн различной длины, воздействие лазера, применение псораленов, различных химических агентов и многообразные комбинации этих методов. Эффективность лечения при этом зависит от ряда факторов, из которых основными являются возраст пациентов, длительность заболевания и наличие сопутствующих патологий.
Таким образом, налицо противоречие между двумя разнонаправленными подходами к лечению депигментации — с помощью подавления и, напротив, индукции свободнорадикального окисления. Данное противоречие указывает на необходимость предварительной оценки антиоксидантного статуса и интенсивности свободнорадикальных реакций кожи у больных витилиго с целью дальнейшего выбора адекватного лечения.
Существует несколько основных трудностей в решении этого вопроса. Во-первых, до последнего времени оценку депигментированной кожи больных витилиго проводили при ее сравнении с нормально пигментированной кожей здоровых людей. Однако для выявления истинного состояния про- и антиоксидантного статуса в депигментированном пятне необходимо сравнение их с нормально пигментированными участками кожи этих же больных. Поэтому задачей нашего исследования стала оценка про- и антиоксидантных факторов в пигментированных и депигментированных участках кожи одного и того же больного витилиго. Во-вторых, сложна проблема выбора наиболее оптимальных параметров для адекватной оценки уровня свободнорадикального окисления и антиоксидантов. Как известно, функционально значимым является не столько абсолютный уровень про- или антиоксидантов в клетке, сколько соотношение между ними. Особенно важно оценить не исходный уровень продуктов свободнорадикального окисления, а результирующую чувствительность ткани к окислительным процессам. При витилиго это приобретает особое значение в связи с прогнозированием чувствительности кожи таких больных к действию индукторов активных форм кислорода (АФК), в частности ультрафиолета.
Цель работы — изучение в депигментированных участках кожи больных витилиго уровня антиоксидантной защиты и резистентности клеток кожи к свободнорадикальным процессам и сравнение полученных показателей с таковыми в пигментированных участках тех же больных. Оценку про- и антиоксидантных компонентов проводили в биоптатах кожи больных витилиго 2 возрастных групп с помощью разработанного нами метода.
При разработке метода использовали немногочисленные и зачастую противоречивые литературные данные относительно состояния антиоксидантной системы и уровня свободнорадикальных продуктов в коже больных витилиго. Кроме того, учитывали также результаты оценки про- и антиоксидантного статуса, проведенной на других органах, в которых прямо показано, что повышение уровня антиоксидантной защиты не гарантирует состояние компенсации процессов с участием АФК, а указывает скорее на его интенсификацию. Действительно, именно появление избыточного уровня АФК приводит к активации различных белков срочного ответа, в том числе и с антиоксидантной функцией. Таким образом, для оценки соотношения свободнорадикальных процессов и уровня антиоксидантов в коже необходим был выбор адекватного, доступного и информативного способа оценки интенсивности свободнорадикальных реакций и антиоксидантных систем в коже при этом заболевании.
Исследуя витилиго и другие кожные заболевания, многие исследователи, в том числе и большинство зарубежных, ограничиваются определением различных параметров, связанных с оксидантным — антиоксидантным балансом в клетках и сыворотке крови, но не в коже. Связано это со сложностью и трудоемкостью работы с кожей, а также малым объемом биоптатов. Кроме того, при заборе материала у пациентов возникают этические проблемы. Однако по результатам, полученным по соотношению про- и антиоксидантов при их измерении в крови, весьма трудно судить о процессах, протекающих непосредственно в коже. Такие данные малоинформативны вследствие высокого уровня прямых и непрямых антиоксидантов в клетках и сыворотке крови, что выражается зачастую в отсутствии изменений в уровне про- и антиоксидантов крови при различных патологиях. В наших экспериментах все параметры определялись непосредственно в коже больных витилиго.
Правда, существуют работы, в которых регистрацию про- и антиоксидантных компонентов проводили непосредственно в коже. Однако такие способы имеют свои недостатки и ограничения. Так, применяемый в последние годы способ оценки свободнорадикального окисления в коже с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса требует высокой чувствительности, специального дорогостоящего оборудования, что ограничивает функциональные возможности этого метода в клинике.
Известен также способ оценки свободнорадикального окисления в коже по измерению уровня одного из продуктов этого процесса — малонового диальдегида и его производных. Однако, несмотря на его доступность, способ малоинформативен, поскольку при этом в коже измеряют только начальный, исходный уровень продуктов окисления. До настоящего времени именно этот параметр остается широко используемым и зачастую единственным, характеризующим степень защиты ткани от свободнорадикального окисления. В то же время в многочисленных работах показано отсутствие изменений исходного уровня свободнорадикальных продуктов при окислительном стрессе различной природы и отсутствие корреляции между состоянием организма (стресс, ишемия, температурный шок и адаптация) и начальным уровнем продуктов окисления.
Какой же параметр следует использовать в таком случае? В специально проведенном исследовании с применением многофакторного корреляционного анализа была выявлена роль отдельных компонентов про- и антиоксидантной системы и оказалось, что наиболее показательным является изучение не начального уровня свободнорадикального окисления, а кинетики накопления продуктов окисления при его индукции in vitro органическими гидроперекисями и эндогенными или экзогенными системами окисления. Поэтому в нашем методе измеряли как начальный уровень тиобарбитурат-активных продуктов свободнорадикального окисления, так и уровень их накопления при индукции in vitro свободнорадикального окисления в биоптатах кожи больных витилиго.
На основе проведенного анализа методов регистрации про- и антиоксидантов, их достоинств, недостатков и ограничений мы разработали эффективный и адекватный состоянию ткани способ определения состояния свободнорадикального окисления и антиоксидантных систем в участках поражения кожи у больных витилиго (патент на изобретение N 2241992 - 2003). В депигментированных и пигментированных участках кожи больных витилиго (биоптаты) на первом этапе определяли уровень ферментов антиоксидантной защиты — каталазы, супероксиддисмутазы, глугатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Затем, учитывая интенсивность изменения их активности, выбирали систему окисления, проводили индуцированное in vitro свободно-радикальное окисление и регистрировали уровень тиобарбитурат-активных продуктов до индукции и в ходе окисления.
В заключение сопоставляли изменения в соотношении про- и антиоксидантов в депигментированных пятнах и участках здоровой кожи одних и тех же больных витилиго. Полученные результаты характеризовали чувствительность кожи к АФК-повреждающим агентам. Для биопсии были выбраны 2 группы больных мужского пола 1-я группа — мужчины 20 - 24 лет и 2-я группа — подростки от 14 до 16 лет Учитывая этические проблемы при заборе материала, изучение компонентов про- и антиоксидантных систем в коже больных витилиго проводилось ограниченно: в 1-й группе протестировано 5 пациентов, а во 2-й — 3.
Оказалось, что депигментированные пятна отличаются от пигментированных пятен одних и тех же больных витилиго значительной модуляцией активности ферментов антиоксидантной защиты, за исключением глутатионпероксидазы, активность которой достоверно не различалась в пятнах витилиго по сравнению с контрольными участками кожи тех же больных. Выявили существенное повышение активности фермента антиоксидантной защиты — супероксиддисмутазы (достоверно р<0,01), в среднем на 47% — в 1-й группе и на 35% — во 2-й (см. рисунок). Изменения активности супероксиддисмутазы у всех пациентов были однонаправленными; показатель увеличения активности этого фермента колебался в 1-й группе — от 31 до 54%, а во 2-й — от 27 до 47%. Активность глутатионредуктазы повышалась незначительно — на 16%, но достоверно в обеих группах.
Изменения показателей активности каталазы у разных пациентов весьма значительны, в результате чего средние значения ее активности достоверно не отличаются в депигментированных и пигментированных участках. В 1-й группе пациентов увеличение активности каталазы достигало 14-22%, а ингибирование 8-12%. Во 2-й группе наблюдалась аналогичная ситуация. Ограничение в численности протестированных больных не позволяет сделать более определенные выводы относительно изменения активности каталазы. Однако можно утверждать о значительно повышенной активности супероксиддисмутазы в депигментированных участках кожи по сравнению с таковым показателем в пигментированных участках. Изменение активности этого фермента обычно регистрируют при хронических заболеваниях, старении, при сравнении различных линий экспериментальных животных либо животных разного пола и возраста. Активация фермента редко достигает 20-25%, поэтому обнаруженная нами экстраординарная степень активации этого фермента (до 54%) указывает на возможную высокую интенсивность свободнорадикальных процессов.
Действительно, уже оценка начального уровня продуктов свободнорадикального окисления в 1-й группе подтвердила наши предположения — у всех пациентов этот показатель был повышен в среднем на 23% (см. рисунок). Индукция окисления in vitro позволила выявить еще более заметные изменения. Через 20 и 40 мин инкубации накапливалось соответственно на 38 и 45% больше продуктов свободно-радикального окисления в участках депигментированной кожи, чем в пигментированной.
Изменения в депигментированном пятне больных витилиго в 1-й и 2-й группах (в % от значений в пигментированных участках кожи тех же больных) активности ферментов антиоксидантной защиты (1 — каталаза, 2 — супероксиддисмутаза, 3 — глутатионпероксидаза, 4 — глутатионредуктаза) и уровня свободнорадикального окисления (5 — исходный уровень продуктов окисления, 6 — скорость накопления продуктов при индукции свободнорадикального окисления in vitro).
Таким образом, в 1-й группе пациентов зарегистрировано значительное повышение интенсивности свободнорадикального окисления, увеличение чувствительности депигментированных участков кожи к АФК-индуцированным процессам на фоне резкой активации супероксиддисмутазы и в ряде случаев - каталазы. Можно констатировать, что чрезмерный уровень АФК, закономерно вызывающий активацию эндогенной антиоксидантной защиты, не может быть компенсирован даже с помощью значительного увеличения активности ее компонентов. В данном случае наблюдается срыв равновесного балансного уровня про- и антиоксидантов. Такие пациенты, по-видимому, нуждаются в фармакологической коррекции с целью повышения антиоксидантного статуса клеток кожи.
Учитывая резкую активацию супероксиддисмутазы, зарегистрированную нами в 1-й группе, дополнительное внесение именно этого антиоксиданта может положительно сказаться при лечении этих пациентов. В настоящее время применяют экзогенное внесение ферментов антиоксидантной защиты в виде рекомбинантных форм, в том числе рекомбинантной супероксиддисмутазы (производство НПП "ТРИС" ). Как показали результаты наших экспериментов, так можно предупредить активацию свободнорадикального окисления при действии кислотного.
Во 2-й группе пациентов, т. е. у подростков, также было проанализировано соотношение про- и антиоксидантного статуса депигментированных участков кожи. Выявилась совершенно иная картина, нежели в 1-й группе. Активность супероксиддисмутазы в очагах витилиго была выше, чем в пигментированных участках кожи. Однако в отличие от 1-й группы, в которой наряду с резкой активацией антиоксидантной защиты не происходило компенсации свободнорадикального окисления, а интенсивность, его, напротив, возрастала, активация эндогенной антиоксидантной защиты во 2-й группе способствовала существенной компенсации свободнорадикальных процессов в очаге витилиго. Исходный уровень тиобарбитуратактивных продуктов не менялся, а при индукции окисления in vitro повышение уровня продуктов окисления на 18% в депигментированном участке кожи, по сравнению с пигментированным, зарегистрировано лишь при 20 мин инкубации.
Таким образом, налицо принципиальная разница в соотношении про- и антиоксидантных компонентов у взрослых и подростков, больных витилиго. Очаг витилиго в обоих случаях характеризуется повышенным уровнем ферментов антиоксидантной защиты, что позволяет частично компенсировать интенсивность АФК-зависимых процессов у подростков. У взрослых пациентов аналогичной компенсации не происходит, видимо, антиоксидантная защита оказывается недостаточной.
Итак, оценка про- и антиоксидантного статуса больных витилиго позволяет выбрать наиболее адекватный и эффективный способ коррекции этого заболевания, что возможно либо с помощью антиоксидантов, либо используя стимуляцию свободнорадикальных процессов. При этом терапия должна подбираться для конкретного пациента с определенным, строго индивидуальным соотношением про- и антиоксидантных компонентов.
Т. Г. Сазонтова, Е. В. Дворянкова, И. М. Корсунская, С. Б. Ткаченко, А. Г. Жукова
МГУ им. М. В. Ломоносова, Кожно-венерологический диспансер N 15, ММА им. И. М. Сеченова